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液體活檢是指非固體生物組織的取樣和檢測(cè)，來(lái)源一般是血液和尿液，對(duì)象包括血漿游離DNA/RNA、血液循環(huán)腫瘤細(xì)胞和外泌體。與傳統(tǒng)的固體活檢相比，液體活檢技術(shù)可以無(wú)創(chuàng)取樣，并且能跟蹤檢測(cè)基因和生物標(biāo)志物。目前這種無(wú)創(chuàng)技術(shù)應(yīng)用于癌癥治療和產(chǎn)前篩查等。

液體活檢：無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（NIPT）

NIPT發(fā)展

NIPT應(yīng)用

NIPT檢測(cè)內(nèi)容

NIPT技術(shù)

NIPT發(fā)展

NIPT發(fā)展迅速，而且它還不是標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療項(xiàng)目，只是一個(gè)選擇項(xiàng)目。

NIPT發(fā)展快速得異常，消費(fèi)者在推進(jìn)?？赡茉颍和缴缃幻襟w發(fā)展，討論較多。

NIPT應(yīng)用

NIPT在實(shí)際運(yùn)用中要解決的問(wèn)題：

市場(chǎng)壓力

專(zhuān)業(yè)指南的快速變化。高風(fēng)險(xiǎn)孕婦和一般孕婦做咨詢(xún)用的時(shí)間都不一樣。那么獲得的信息也不同。孕婦查出有問(wèn)題不一定要終止妊娠，還可以多做應(yīng)對(duì)準(zhǔn)備。而且做繼續(xù)懷孕決定的比例達(dá)到了40%。

NIPS在產(chǎn)前檢測(cè)中的準(zhǔn)確定位。一開(kāi)始定位是高危產(chǎn)婦，之后不是高危產(chǎn)婦也對(duì)NIPT有興趣。中等風(fēng)險(xiǎn)妊娠群體的NIPT檢測(cè)，還會(huì)再上升。

NIPT的檢測(cè)

NIPT的檢測(cè)還不是準(zhǔn)確。

低風(fēng)險(xiǎn)用戶越多，PPV值越低。

生物學(xué)原因?qū)е碌哪阁w的miccroduplications也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

NIPT和標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)前檢測(cè)項(xiàng)目的比較

標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)前檢測(cè)項(xiàng)目：血清生化檢測(cè)和nuchal translucency超聲波檢查。

NIPT在在某些檢測(cè)方面的錯(cuò)誤率格外低，比如cfDNA陽(yáng)性預(yù)測(cè)方面比標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目做得好。

NIPT的可選項(xiàng)目:性染色體

常規(guī)染色體非整倍體異常項(xiàng)目：21- 三 體 綜 合 征（trisomy 21，T21）、18-三體綜合征（trisomy 18，T18）和 13-三體綜合征（trisomy 13，T13）。

檢測(cè)可選項(xiàng)目：性染色體等。NIPT能比超聲波更早知道是否有性別染色體異常。

NIPT技術(shù)

美國(guó)NIPS的四個(gè)公司：4種技術(shù)。檢測(cè)錯(cuò)誤率差別較大。

Illumina：WGS 全基因組測(cè)序

Sequenom：WGS 全基因組測(cè)序

Ariosa Diagnostics：targeted approach on a microarray 微陣列靶向方法

Natera：targeted sequencing for SNP 靶向測(cè)序檢測(cè)單基因

液體活檢：腫瘤CTC和ctDNA

原發(fā)腫瘤（乳房、結(jié)腸、肺、前列腺癌）在形成生長(zhǎng)早期，會(huì)釋放細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)。通過(guò)各種技術(shù)可以富集檢測(cè)這些循環(huán)腫瘤細(xì)胞的物理和生物性質(zhì)。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞，Circulating Tumor cell，簡(jiǎn)稱(chēng)CTC。CTC釋放點(diǎn)：原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤。

CTC死亡后還會(huì)釋放出循環(huán)腫瘤DNA，Circulating Tumor DNA，簡(jiǎn)稱(chēng)ctDNA。

CTCs和ctDNA的分析是液體活檢診斷的基石。

CTC和ctDNA的臨床應(yīng)用

腫瘤檢測(cè) CTCs和ctDNA應(yīng)用腫瘤的早期檢測(cè)很受關(guān)注，面臨的挑戰(zhàn)是目前分析的特定性和敏感度。

預(yù)后評(píng)估 多種腫瘤已經(jīng)實(shí)現(xiàn)預(yù)后評(píng)估，尤其是乳癌。

指導(dǎo)系統(tǒng)治療

病人亞群分類(lèi)（stratification）。

CTC研究進(jìn)展

CTC研究是很活躍的領(lǐng)域，截止2015年12月發(fā)表在PubMed的文獻(xiàn)有17000篇。隨著循環(huán)游離腫瘤DNA分析的發(fā)展，zui近才開(kāi)始使用“液體活檢”這個(gè)條目。分子水平的靈敏分析方便研究者從血漿中篩選特定腫瘤突變的ctDNA，因此ctDNA和CTC成為富有競(jìng)爭(zhēng)力的生物標(biāo)志物。

液體活檢血漿DNA保存、純化、文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序產(chǎn)品（高通量測(cè)序法）

血液標(biāo)本采集、運(yùn)輸、保存

血漿游離DNA提取純化

血漿游離DNA基因文庫(kù)構(gòu)建

文庫(kù)產(chǎn)物純化

基因測(cè)序

外周血游離DNA標(biāo)本采集、運(yùn)輸、保存

外周血血漿游離DNA采集：EDTA 抗凝管或者 Streck Cell-Free DNA BCT 管

Streck Cell-Free DNA BCT® 血漿游離DNA采血管

產(chǎn)品英文名稱(chēng)：Streck Cell-Free DNA BCT® BLOOD COLLECTION TUBE

產(chǎn)品中文名稱(chēng)：Streck BCT® 血漿游離DNA采血管

Streck 血漿游離DNA采血管是一種直接提取的全血收集管，用于收集、運(yùn)輸和儲(chǔ)存血液樣本。Streck 血漿游離DNA采血管內(nèi)含防腐劑，它能穩(wěn)定有核血細(xì)胞，防止細(xì)胞基因組DNA的釋放，保護(hù)血漿游離循環(huán)DNA和循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）。

230253是218962的升級(jí)版，是Streck公司新推將玻璃和塑料的*性能融合在一起的Fusion2^TM混合塑料管。

EDTA抗凝管參見(jiàn)BD真空采血管分類(lèi) 血清 血漿 單個(gè)核細(xì)胞 RNA 肝素 EDTA

血漿游離DNA提取純化

磁珠法或離心柱法

離心柱法產(chǎn)品：

QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit 循環(huán)核酸純化試劑盒

貨號(hào)： 55114 品牌：Qiagen

QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50)

For 50 preps: QIAamp Mini Columns, Tube Extenders (20 ml), QIAGEN Proteinase K, Carrier RNA, Buffers, VacConnectors, and Collection Tubes (1.5 ml and 2 ml)

樣品處理量：5mL

洗脫體積：20-150μL

可以洗去PCR抑制物，如：二價(jià)陽(yáng)離子和蛋白

血漿游離DNA文庫(kù)構(gòu)建

ThruPLEX® Plasma-seq Kit血漿游離DNA文庫(kù)構(gòu)建試劑

ThruPLEX® Plasma-seq基于ThruPLEX技術(shù)，并用于血漿來(lái)源cfDNA高品質(zhì)NGS文庫(kù)構(gòu)建。該試劑專(zhuān)門(mén)針對(duì)cfDNA進(jìn)行優(yōu)化，在保持樣本GC代表性的基礎(chǔ)上，提升了文庫(kù)的信息容量。文庫(kù)構(gòu)建后可用于CNV分析、全基因組測(cè)序分析或是采用一些panel針對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行捕獲富集后的DNA分析,如Agilent SureSelect® and Roche NimbleGen SeqCap® EZ。

血漿樣品采用ThruPLEX Plasma-seq試劑盒制備文庫(kù)，能有更好的靈敏度、更準(zhǔn)確的基因變異分析結(jié)果。與其它液態(tài)活檢的樣品一樣，血漿由于其易獲得、價(jià)值高的特點(diǎn)，深受研究腫瘤學(xué)或者孕婦血漿中胎兒游離DNA科研工作者的重視。

文庫(kù)產(chǎn)物純化

Agencourt AMPure XP 核酸純化試劑盒

Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒是一種能夠獲得高質(zhì)量DNA產(chǎn)物的純化試劑盒，純化后的核酸純度高，無(wú)鹽離子殘留，無(wú)需離心或過(guò)濾，目前廣泛應(yīng)用于NGS文庫(kù)構(gòu)建。該試劑的應(yīng)用為產(chǎn)物純化，如：NGS文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中酶聯(lián)體系的純化、PCR產(chǎn)物純化等。既可以手工操作，也可以使用自動(dòng)化工作平臺(tái)以96孔或384孔板的形式完成。

基因測(cè)序

illumina 基因測(cè)序試劑盒

參考文獻(xiàn)

1.吳一龍，等. 液體活檢:規(guī)范與同行.循證醫(yī)學(xué)，2016年04期，P193-197.

2.Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy,

Catherine Alix-Panabières,Cancer Discov;6(5); 479–91. ©2016 AACR Published OnlineFirst March 11, 2016; DOI: 10.1158/2159-8290.CD-15-1483.

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