構(gòu)建一個(gè)高度可重復(fù)的單細(xì)胞文庫(kù)
Rubicon Genomics （RB3050/R30050） PicoPLEX® WGA Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒
The ability to amplify DNA to yield a highly reproducible library from a single cell is now possible! The PicoPLEX WGA kit with patented technology* is designed and optimized for amplification of single copy genomic DNA starting with a single cell. The easy-to-use single tube protocol reduces handling errors, dramatically improves time to results and reduces background. PicoPLEX WGA Kit can be also be used with isolated gDNA amounts ranging from less than 6 pg to 50 pg. Accepted for use in array CGH analysis as well as PCR.
PicoPLEX WGA Kits are used and trusted by leading providers in the IVF community such as BlueGnome for pre-implantation genetic screening and diagnostics (PGS/PGD).
單細(xì)胞全基因組PGS/PGD診斷的金標(biāo)準(zhǔn)
This assay involves removing a polar body from a fertilized egg or single cells from five to ten embryos on day 3 post fertilization. After the cells are lysed, the released DNA is then amplified and the amplification product labeled and hybridized to a microarray containing genomic targets.Software analysis identifies copy number variations. PicoPLEX WGA technology has become the standard DNA amplification technique for PGS due to extreme robustness and reproducibility *的穩(wěn)健性和重復(fù)性. The same PicoPLEX WGA technology can also be applied to genetic characterization of any single cell sample or picogram quantities of isolated DNA.
Overview
Pre-implantation genetic screening and diagnosis (PGS, PGD) refers to testing done to an embryo or oocyte as a part of an in vitro fertilization (IVF) procedure to select embryos that do not have chromosomal disorders or carry familial disease alleles, increasing the chance of successful pregnancy and decreasing the risk of passing on certain genetic disorders. Microarray analysis is the most common PGS technique performed in IVF clinics, and several kits that contain PicoPLEX technology are widely available. These include Illumina’s 24Sure Arrays, Perkin Elmer’s KaryoLite BoBs developed for PSG and Oxford Gene Technology’s CytoSure™ Arrays. Labs are increasingly turning to low pass NGS for these assays and PicoPLEX DNA-seq was developed to fill this need.
Workflow
PicoPLEX Technology*
PicoPLEX uses random primer extension with non-complementary primers to yield a library with a high systematic bias and very low stochastic bias.
微量DNA的金鑰匙：?jiǎn)渭?xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒 三步法可靠 Rubicon Genomics （RB3050/R30050） PicoPLEX® WGA Kit Whole Genome Amplification from Single Cells
Rubicon Genomics成立于2000年，總部位于美國(guó)密歇根州。該公司的核心競(jìng)爭(zhēng)力產(chǎn)品包括酶學(xué)、核酸化學(xué)、樣品的加工生產(chǎn)，該公司致力于創(chuàng)新、知識(shí)產(chǎn)權(quán)的發(fā)展和持續(xù)的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。
Rubicon Genomics開(kāi)發(fā)創(chuàng)新、高品質(zhì)的、核酸文庫(kù)的制備及配套產(chǎn)品，能夠?qū)εR床樣本進(jìn)行簡(jiǎn)單、快速可靠和高靈敏度的分析。
美國(guó)Rubicon Genomics---單細(xì)胞測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建的
1. 二代測(cè)序建庫(kù)試劑（微量起始樣品 50pg - 50ng）
2. 單細(xì)胞擴(kuò)增和單細(xì)胞測(cè)序建庫(kù)試劑（廣泛應(yīng)用于生殖領(lǐng)域，是該領(lǐng)域的金標(biāo)準(zhǔn)。）
3. 全RNA擴(kuò)增試劑（微量起始樣品，可以低至10個(gè)細(xì)胞的總RNA）
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【產(chǎn)品介紹】
Rubicon Genomics （RB3050/R30050） PicoPLEX® WGA Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒
是應(yīng)用于一般用途的Illumina下一代測(cè)序（NGS）的高性能文庫(kù)，ThruPLEX的DNA測(cè)序試劑盒具有較低的和更廣泛的輸入范圍。PicoPLEX® WGA Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒具有較低的和更廣泛推薦的輸入范圍比其他工具包。對(duì)于Rubicon Genomics 的PicoPLEX® WGA Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒樣品輸入量為20倍，比其他套件更為敏感，從第50和50納克，不需要協(xié)議或適配器濃度的優(yōu)化。索引和適配器附帶套件。
PicoPLEX® WGA Kit高性能的zui低輸入：50 PG 50納克
PicoPLEX® WGA Kit完整的包，用于創(chuàng)建庫(kù)：優(yōu)化索引和適配器試劑，酶，緩沖劑，和無(wú)核酸酶水
PicoPLEX® WGA Kit 其操作僅在一個(gè)管3步驟和僅約2小時(shí)，沒(méi)有必要調(diào)劑
【產(chǎn)品性能】
Rubicon Genomics （RB3050/R30050） PicoPLEX® WGA Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒
Amplification of Single Cells is Reproducible
Flow-sorted cancer cells were amplified with the PicoPLEX WGA Kit. Each of the cells (blue lines) amplified at the same rate, and resulted in a similar, predictable yield. The sample containing 0 cells (green lines; no template control) shows very low background.
擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞是可重復(fù)的
流分類的癌細(xì)胞用PicoPLEX® WGA Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增。每個(gè)細(xì)胞（藍(lán)線）以相同的速率擴(kuò)增，并導(dǎo)致類似的，可預(yù)測(cè)的產(chǎn)率。包含0個(gè)單元格（綠線，沒(méi)有模板控制）的樣本顯示非常低的背景。
單細(xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)是在單細(xì)胞水平對(duì)全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序的一項(xiàng)技術(shù)，其原理是對(duì)分離的單個(gè)細(xì)胞的微量全基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得高覆蓋率的完整的基因組后進(jìn)行高通量測(cè)序，廣泛應(yīng)用于癌癥研究、胚胎發(fā)育、輔助生殖、細(xì)胞分化、免疫機(jī)制、微生物等方向的研究。
獲得高覆蓋度高保真性的全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物是準(zhǔn)確全面的測(cè)序結(jié)果的保障。為了保證基因組高覆蓋度無(wú)偏好性的擴(kuò)增，在單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)誕生的近二十年時(shí)間里，全基因組擴(kuò)增技術(shù)經(jīng)歷了幾次重大的變革，WGA主要有三種方式：DOP-PCR，MDA，MALBAC。下面小編就來(lái)為大家介紹一下WGA技術(shù)的演變歷程，以及怎樣根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)的擴(kuò)增方式。
DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide–Primed Polymerase Chain Reaction)
技術(shù)原理：簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR，引物的3' 含6bp的隨機(jī)序列，可以隨機(jī)的和基因組DNA結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)全基因組的擴(kuò)增[1]。
應(yīng)用范圍：因?yàn)镻CR的指數(shù)擴(kuò)增特性，放大了基因組上不同序列之間的差異，因而導(dǎo)致擴(kuò)增出的基因組覆蓋度較低。盡管如此，在1M bin size的水平上，DOP-PCR適合對(duì)染色體的CNV進(jìn)行定量。
MDA技術(shù)原理：2001年由Laskin團(tuán)隊(duì)發(fā)明，使用隨機(jī)的六聚體引物和φ29DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，該聚合酶具有很強(qiáng)的鏈置換特性，能夠在等溫的條件下，擴(kuò)增產(chǎn)生50~100kb的DNA片段。同時(shí)由于其3’-5’核酸外切酶活性和校對(duì)活性，φ29 DNA聚合酶具有很高的復(fù)制保真性[2]。
應(yīng)用范圍：MDA法比DOP-PCR擁有更高的基因組覆蓋度，φ29 DNA聚合酶的率及高保真性，使得MDA法在對(duì)SNV的分析，以及構(gòu)建大片段文庫(kù)上有著顯著優(yōu)勢(shì)。但是，和DOP-PCR相同，MDA法依然是指數(shù)擴(kuò)增，因此依然存在PCR反應(yīng)的序列偏好性，然而，和DOP-PCR不同的是，這種偏好性并不能重復(fù)，因此MDA法不適合進(jìn)行CNV的分析。商品化試劑盒代表：Qiagen, REPLI-g Single Cell Kit。
MALBAC技術(shù)原理：2012年由謝曉亮團(tuán)隊(duì)發(fā)明，擬線性的擴(kuò)增過(guò)程降低了指數(shù)擴(kuò)增的序列偏好性。擴(kuò)增引物的5’含有27bp的共同序列，3’是8bp的隨機(jī)序列，可以和模板在15~20℃的低溫下結(jié)合，經(jīng)過(guò)8~12個(gè)循環(huán)的擬線性擴(kuò)增后，再對(duì)這些環(huán)狀的擴(kuò)增子進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增[3]。
應(yīng)用范圍：MALBAC法的優(yōu)勢(shì)在于，雖然它依然存在一定的序列偏好性，但和MDA不同，MALBAC的這種偏好性在不同的細(xì)胞之間是可重復(fù)的，因此可以通過(guò)對(duì)參考細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行CNV的分析；另外，由于其擴(kuò)增的均一性，MALBAC法擴(kuò)增的等位基因敲除率更低。MALBAC的弱點(diǎn)在于，它使用的聚合酶保真性不如φ29，因此MALBAC在檢測(cè)SNV時(shí)將會(huì)出現(xiàn)更多的假陽(yáng)性；另外，由于它可重復(fù)性的序列偏好性，基因組上低擴(kuò)增的區(qū)域有時(shí)會(huì)在擴(kuò)增過(guò)程中丟失。商品化試劑盒代表：Yikon, Single Cell Whole Genome Amplification Kit; Rubicon, PicoPLEX WGA Kit。
由上述的分析可見(jiàn)，MDA和MALBAC各有優(yōu)劣，實(shí)際上在不同的文獻(xiàn)中，研究者也會(huì)根據(jù)研究目的的不同，采取不同的方式對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增，以滿足研究的需要[5-7]。
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